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Dieser Service ermöglicht die Produktion von polyklonalen Antikörpern, die monospezifisch den phosphorylierten Zustand ihres Zielproteins erkennen.


Das Verfahren beinhaltet die Synthese von zwei gleichen Peptidepitopen, die sich nur durch eine Phosphorylierungsstelle innerhalb der Peptidsequenz unterscheiden.

 

Die Tiere werden mit dem phosphorylierten Peptid immunisiert. Das dabei erhaltene Antiserum wird durch zweimalige Affinitätssäulenchromatographie gereinigt.


Ausführliche ELISA Untersuchungen werden sowohl an der Fraktion der „phosphospezifischen Antikörper“, als auch an der Fraktion, die für den „nicht-phosphorylierten Zustand des Antigens“ spezifisch ist, durchgeführt.


Sie erhalten die Antikörper aus beiden Fraktionen, sowie die ausführlichen ELISA Analysedaten in einer zusammenfassenden Dokumentation.


Genosphere Biotechnologies hat dieses Verfahren bereits hundertfach erfolgreich zum Nachweis von phosphorylierten, methylierten, acetylierten und glykosylierten Proteinen angewandt.


Die phosphospezifischen polyklonalen Antikörper stellen somit eine preiswerte Alternative zu ihren monoklonalen Gegenstücken dar.

Der Service  besteht aus den folgenden Arbeitsabschnitten:

  1. Sie wählen auf ihrem Protein das Peptidepitop  aus. Idealerweise ist das Epitop  10 AS bis 15 AS lang und weist am N- oder C-Terminus ein Cystein auf. Längere Epitopabschnitte sind  ebenfalls möglich. *)
  2. Wir synthetisieren für Sie dieses Peptidepitop und das phosphorylierte  Analogon.
  3. Wir konjugieren das phosphorylierte Peptid an KLH und immunisieren zwei Kaninchen *) damit. Wir führen hierzu 4 Immunisierungsschritte innerhalb von 70 Tagen durch.
  4. Die Seren der Tiere werden über zwei Affinitätschromatographiesäulen gereinigt. Das Säulenfüllmaterial der einen Säule ist mit dem unphosphorylierten Peptid und das Säulenfüllmaterial der anderen Säule mit dem phosphorylierten Peptid gekoppelt.  
  5. Die beiden Eluate werden separat gesammelt und mittels ELISA getestet.
  6. Sie erhalten, getrennt voneinander, die beiden Antikörperfraktionen, die gegen das phosphorylierte  Epitop bzw. gegen das unphosphorylierte Peptid gerichtet sind.
  7. Optional bieten wir Ihnen außerdem die Markierung der affinitätsgereinigten IgG  mit z.B. Biotin, HRP oder Rhodamin an.

*) Gerne unterstützen wir Sie auch bei diesem Arbeitsabschnitt.

**) Wir immunisieren für Sie  auch Ratten, Meerschweinchen und Mäuse. Die Menge der dabei erhaltbaren Antikörper ist jedoch deutlich geringer.  

Herstellung phosphospezifischer Antikörper

  

                 

Peptide, Gene & Antikörper für Ihre Forschung

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phospho AK 11-15.pdf

Effekt der Reinigung von rohen Antiseren durch Protein A - bzw. Affinitätschromato-graphie.

(Protein mit Coomassie angefärbt.)